近日，廣州國(guó)家實(shí)驗(yàn)室范小英教授團(tuán)隊(duì)在Cell Reports(IF 7.5)上發(fā)表了題為“Identification of the core regulatory program driving NEUROD1-induced neuronal reprogramming”的研究成果。研究人員建立了大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞體外重編程系統(tǒng)，通過(guò)單細(xì)胞與多組學(xué)測(cè)序技術(shù)(scRNA-seq、ATAC-seq、Cut&Tag和bulk RNA-seq)系統(tǒng)解析了轉(zhuǎn)錄因子NEUROD1(ND1)驅(qū)動(dòng)星形膠質(zhì)細(xì)胞(Ast)向神經(jīng)元(Neu)轉(zhuǎn)分化的動(dòng)態(tài)軌跡與分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)ND1作為先鋒因子通過(guò)誘導(dǎo)H3K27ac組蛋白修飾重塑染色質(zhì)開(kāi)放性，激活包括Hes6在內(nèi)的25個(gè)關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，其重編程過(guò)程高度模擬了體內(nèi)皮層神經(jīng)發(fā)生。這項(xiàng)研究不僅闡明了星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的獨(dú)特中間態(tài)細(xì)胞及核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更為神經(jīng)損傷修復(fù)和退行性疾病的治療提供了革命性策略。本研究采用真邁生物SURFSeq 5000平臺(tái)完成高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

成年哺乳動(dòng)物大腦的神經(jīng)再生能力極為有限，僅在海馬齒狀回和側(cè)腦室下區(qū)等特定區(qū)域維持微弱再生能力，且新生神經(jīng)元數(shù)量極其有限。傳統(tǒng)外源細(xì)胞移植療法長(zhǎng)期面臨細(xì)胞存活率低、功能整合差等瓶頸問(wèn)題。在這一背景下，星形膠質(zhì)細(xì)胞展現(xiàn)出獨(dú)特的治療潛力。作為大腦內(nèi)數(shù)量最龐大的膠質(zhì)細(xì)胞群體，它們不僅分布廣泛，更在損傷后表現(xiàn)出類似神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的再生特性。這些特性使其成為內(nèi)源性神經(jīng)再生的理想“細(xì)胞寶庫(kù)”。近年研究表明，通過(guò)特定干預(yù)手段可顯著提升膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)轉(zhuǎn)化效率，包括異位表達(dá)促神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄因子，如NEUROD1(ND1)；microRNA 干擾；PTBP1（一種重要的RNA結(jié)合蛋白）基因敲除；小分子化合物處理。作為神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的先鋒轉(zhuǎn)錄因子(TF)，ND1具有快速誘導(dǎo)神經(jīng)元表型的獨(dú)特能力，但其動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍待闡明。過(guò)往研究依賴于bulk RNA-seq，無(wú)法解析重編程過(guò)程中的細(xì)胞異質(zhì)性和多階段分子事件。本研究建立無(wú)內(nèi)源性神經(jīng)元干擾的體外ND1重編程系統(tǒng)，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(scRNA-seq)、染色質(zhì)可及性(ATAC-seq)和組蛋白修飾分析，揭示ND1驅(qū)動(dòng)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為理解神經(jīng)再生機(jī)制提供了新的理論框架。

為探究ND1誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化(AtN)的細(xì)胞機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)建立了體外轉(zhuǎn)分化研究體系。利用新生大鼠大腦皮層分離的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染實(shí)現(xiàn)ND1的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)。研究結(jié)果顯示：在ND1過(guò)表達(dá)第三天時(shí)，經(jīng)典神經(jīng)元標(biāo)志物TUJ1開(kāi)始表達(dá)。隨后，通過(guò)對(duì)0-5天這一關(guān)鍵轉(zhuǎn)換期的scRNA-seq分析揭示了細(xì)胞命運(yùn)決定的動(dòng)態(tài)過(guò)程。完成數(shù)據(jù)過(guò)濾后，0天組捕獲了13,081個(gè)細(xì)胞，GFP對(duì)照組32,741個(gè)細(xì)胞，ND1過(guò)表達(dá)組46,164個(gè)細(xì)胞。研究者共鑒定出三種主要細(xì)胞類型：未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞(ImA)、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte)和神經(jīng)元細(xì)胞(Neuron)。其中ImA可進(jìn)一步分為三個(gè)亞群：增殖態(tài)ImA_div、靜息態(tài)ImA以及高表達(dá)ND1的ImA_ND1_hi，這些亞群均高表達(dá)Gfap與Tnc。Astrocyte也包含三個(gè)亞群：高表達(dá)Gfap/Tnc/Col11a1的Ast_1，以及高表達(dá)Atp1a2/Aqp4的Ast_2與Ast_3。神經(jīng)元分為4個(gè)亞群(Neu_1至Neu_4)，均高表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志基因，且功能富集于軸突發(fā)生，樹(shù)突發(fā)育，神經(jīng)元遷移，以及細(xì)胞突起調(diào)控等神經(jīng)相關(guān)通路。隨著時(shí)間推移，細(xì)胞類型發(fā)生明顯變化：0天時(shí)，80%細(xì)胞為ImA，GFP對(duì)照組主要為ImA和Astrocyte，而ND1過(guò)表達(dá)組大部分細(xì)胞(52.5%)轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。第14天時(shí)，80%的GFP⁺星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)為TUJ1⁺神經(jīng)元，且超過(guò)90%為VGLUT1⁺興奮性神經(jīng)元，其中TBR1⁺與CTIP2⁺細(xì)胞占比較高。30天時(shí)，轉(zhuǎn)分化的神經(jīng)元已具備類似胚胎16.5天大鼠皮層神經(jīng)元的電生理特性，主要形成功能性興奮性神經(jīng)環(huán)路，其放電頻率與振幅與原代神經(jīng)元相當(dāng)。這些結(jié)果證實(shí)了ND1能在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)快速高效的體外神經(jīng)元重編程，首次揭示了通過(guò)ImA_ND1_hi過(guò)渡態(tài)的轉(zhuǎn)分化軌跡，明確了神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化過(guò)程中的連續(xù)細(xì)胞狀態(tài)。

圖1?ND1誘導(dǎo)AtN過(guò)程中的細(xì)胞類型多樣性

通過(guò)整合多種ND1驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)元分化系統(tǒng)，研究者對(duì)ND1的ChIP-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行了重新分析，并與本研究的AtN體系Cut&Tag數(shù)據(jù)進(jìn)行了系統(tǒng)比較。研究團(tuán)隊(duì)共鑒定出40個(gè)跨系統(tǒng)保守的ND1直接靶基因(包括已知的Hes6,?Mfap4,?Smad3等)，這些基因顯著富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)通路。基于scRNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步將靶基因范圍縮小至25個(gè)與ND1表達(dá)密切相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子，其中20個(gè)基因顯著上調(diào)，證實(shí)ND1在AtN過(guò)程中主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用；同時(shí)發(fā)現(xiàn)5個(gè)下調(diào)的星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因，提示ND1還具有直接抑制膠質(zhì)細(xì)胞特性的功能。轉(zhuǎn)錄因子活性分析顯示，Hes6和Smad3在AtN過(guò)程中活性發(fā)生顯著改變，本研究新發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)Meis2在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表現(xiàn)出顯著的TF活性增強(qiáng)。為驗(yàn)證這些核心調(diào)控因子的功能，研究者通過(guò)shRNA對(duì)Hes6和Meis2進(jìn)行了敲低，并結(jié)合真邁生物SURFSeq 5000平臺(tái)的bulk RNA-seq分析轉(zhuǎn)錄組水平的變化。Hes6敲低導(dǎo)致晚期神經(jīng)發(fā)生基因(如Tubb3、Slc1a、Slc17a7)顯著上調(diào)，同時(shí)伴隨TUJ1⁺/GFAP⁺雙陽(yáng)性細(xì)胞比例增加，提示Hes6通過(guò)防止神經(jīng)元基因過(guò)早激活來(lái)確保轉(zhuǎn)分化的時(shí)序性。Meis2敲低顯著降低內(nèi)源ND1表達(dá)及其調(diào)控的神經(jīng)元發(fā)生基因，降低轉(zhuǎn)分化效率，表明Meis2通過(guò)維持ND1的表達(dá)從而驅(qū)動(dòng)完整的神經(jīng)元重編程。這些發(fā)現(xiàn)不僅揭示了ND1通過(guò)共同的核心靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控神經(jīng)元分化的分子基礎(chǔ)，還闡明了Hes6和Meis2在AtN中的作用機(jī)制。

圖2?參與神經(jīng)元重編程的關(guān)鍵ND1靶點(diǎn)